您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2024-11-22 20:22
摘 要 / Abstract
為探究糖脂協同抑制馬拉色菌活性的效果，采用Box -Behnken 設計( Box -Behnken design,BBD)響應面優化法，使用Design -Expert 軟件優化模擬以糖脂（A）、迷迭香葉水（B）、側柏葉提取物（C）為去屑組合物，探究組合物的配比對馬拉色菌抑菌率的影響。結果顯示，單因素間對抑菌率的影響程度為A≈B>C，而兩兩因素相互間交互影響大小為AB>AC>BC。在最佳條件組合下（47%糖脂、28%迷迭香葉水、8%側柏葉提取物），抑菌率為96.50%。植物提取物在特定比例下（迷迭香∶側柏= 25.8 ∶12.8），糖脂與植物提取液聯用時，協同聯合作用指數（CI）為0.4795，表現出顯著的協同抑制效應。將此優化的去屑組合物添加于頭皮去屑精華液中，有效抑制馬拉色菌生長P<0.05），驗證了其優良的去屑功效。
In order to explore the effect of glycolipids on the synergistic inhibition of Malassezia, the Box-Behnken design (BBD) response surface optimization method and the Design-Expert software were used to optimize and simulate the anti-dandruff composition of glycolipids (A), Rosmarinus officinalis leaf water (B), and Platycladus orientalis leaf extract (C), The effect of the ratio of these components on the inhibition rate of Malassezia was investigated. The results showed that the influence of individual factors on the inhibition rate was A≈B>C, while the interaction between two factors followed the order AB>AC>BC. Under the optimal combination of conditions (47% glycolipids, 28% Rosmarinus officinalis leaf water, 8% Platycladus orientalis leaf extract ), the inhibition rate was96.50%. When the plant extracts were combined at a specific ratio Rosmarinus officinalis leaf water ∶Platycladus orientalis leaf extract =25.8 ∶12.8), the synergistic combination index (CI) was 0.4795 when glycolipids were used in combination with the plant extracts, indicating a significant synergistic inhibition effect. This optimized anti-dandruff composition was ther added to a scalp anti-dandruff essence, which effectively inhibited the growth of Malassezia (P<0.05), confirming its excellent anti-dandruff effect.
關 鍵 詞 / Key words
糖脂；馬拉色菌抑菌率；響應面法；協同聯合作用指數；去屑
glycolipids; Malassezia inhibition rate; Box-Behnken Design; synergistic combination index; anti-dandruff
馬拉色菌被認為是頭皮屑感染的主要致病微生物[1]。該真菌通過馬拉色菌脂肪酶LIP1（SMG1）增殖，這種酶在脂質代謝過程中產生不飽和的游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）。FFAs參與了真菌的致病性，誘導皮膚炎癥、瘙癢、表皮細胞過度增生，最終造成頭屑[2-3]。
目前，化妝品中常用的去屑劑為吡硫鎓鋅、吡羅克酮乙醇胺鹽、氯咪巴唑、二硫化硒、水楊酸等。但這些物質具有一定的致敏性、刺激性和不穩定性，其效果不可預測，易出現副作用[4]。去屑劑的種類不僅決定去屑效果優劣，而且對消費者的健康和安全也有一定的影響[5]。
糖脂是由非致病性酵母菌產生的可降解的天然生物表面活性劑[6]，其具有獨特的生物活性[7]，在糖類生物表面活性劑中，具有應用潛力[8]。糖脂通過β-1，2-糖苷鏈與C16—C18的羥基脂肪酸鏈連接，以酸型和內酯型兩種形式存在，因其具有抗菌、抗病毒等活性，廣泛應用于制藥、化妝品、公共衛生及農業領域[9-10]。
植物抑菌劑作為一種純天然綠色抑菌劑，主要是起到抑制微生物細菌繁殖的作用，在實際應用中范圍較廣。植物抑菌劑以其刺激性小、安全性高的優勢，受到了社會各界的廣泛關注[11]，為化妝品行業開發新型安全高效綠色的去屑活性成分提供研究思路。
1、實 驗
1.1 材料
迷迭香葉（亳州市迎真堂藥業有限公司，批號20220727）、側柏葉（亳州市迎真堂藥業有限公司，批號20220139）；糠秕馬拉色菌（廣東省環凱微生物科技有限公司，型號GDMCC2.181）；馬拉色菌培養基基礎（Leeming-Notman agar Modified，MLNA）（山東拓普生物工程有限公司，批號20220919）；0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）（青海博生物技術有限公司，批號2022052301）；六水合氯化鎂（國藥集團化學試劑有限公司，批號20221421）。
熊蜂生假絲酵母（上海保藏生物技術中心，ATCC 22214）；酵母霉菌瓊脂（Yeast Mold Agar，YM Agar）（上海瑞楚生物科技有限公司，批號20220720）；酵母霉菌肉湯（Yeast Mold Broth，YM Broth）（上海瑞楚生物科技有限公司，批號20220726）；葡萄糖（西安藥業有限公司，批號20220815A），酵母粉（安琪酵母股份有限公司，FM802，批號2022081501B5），磷酸二氫鉀（KH2PO4）（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號P815662-500g），無水硫酸鎂（MgSO4）（西隴科學股份有限公司，批號210601-2），氯化鈉（NaCl）（湖北藍天鹽化有限公司，批號20220524），無水氯化鈣（CaCl2）（西隴科學股份有限公司，批號220412-1），蛋白胨（安琪酵母股份有限公司，FP103，批號2022070401B1），菜籽油［嘉吉糧油（南通）有限公司，批號20220620］。
1.2 儀器
KBF240恒溫恒濕培養箱（德國賓德有限責任公司）；BSC-1604 Ⅱ A2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；CL-32L高壓滅菌器（日本ALP）；SQL1010C高壓滅菌鍋（重慶雅瑪拓機械制造科技有限公司）；DW-25L262低溫冰箱（海爾公司）；VXR Basic小型震蕩器（德國艾卡公司）；T&J-Intelli-Ferm A 10L發酵罐[迪必爾生物工程（上海）有限公司]；SBA-50B+生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）；ME3002E電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；Design-Expert10.0.7軟件。
1.3 實驗方法
1.3.1 糖脂制備
首先挑取熊蜂生假絲酵母菌株在YM 固體培養基上平板劃線活化/試管斜面，30℃培養48h 進行菌株活化，獲得單菌落，4℃試管保存留用。從平板上挑取單菌落接種至50ml YM 液體培養基中，在30℃、220rpm 條件下，搖床培養48h，作為種子液備用。向發酵罐中加入4L 發酵培養基（葡萄糖100g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.076g/L，NaCl 0.1g/L，CaCl2 0.244g/L，蛋白胨0.7g/L，菜籽油50g/L，溶劑為無菌水）和適量種子液進行發酵，每8 小時監測一次葡萄糖和菜籽油含量，當葡萄糖濃度低于20g/L、油脂含量低于10g/L 時，補充葡萄糖和菜籽油，維持葡萄糖濃度在25~30g/L，菜籽油濃度在15~20g/L 范圍內，發酵48h 后停止補充糖、油， 由其自行將葡萄糖、菜籽油消耗完全，96h 時結束。發酵結束后，將發酵罐升溫至60℃，維持20 ~30min 使酵母菌失活。分離收集底部棕黃色油狀黏稠狀糖脂，加入等體積55 ~65℃溫熱的蒸餾水混勻，以洗掉剩余的親水雜質，并再次加熱55 ~65℃以促進水和糖脂之間的分離。靜置分層，取下層油狀產物，上層水相可合并菌液層一同處理。重復水洗2~3 次，以得到澄清棕黃色黏稠狀糖脂，25℃保存備用[12]。
1.3.2 迷迭香葉水制備
取適量干燥迷迭香葉藥材，磨成40 ~80 目的細粉，將迷迭香葉藥材和水按質量配比1∶4 投入回流罐中，95℃加熱回流，從水開始回流計算時間，提取時間為2.5h，回流完成后過濾并收集提取液，合并提取液，得到淡棕色透明液體，備用。
1.3.3 側柏葉提取物制備
取適量干燥側柏葉藥材，磨成40 ~ 80 目的細粉，將側柏葉藥材和水按質量配比1∶4 投入回流罐中，95℃加熱回流，從水開始回流計算時間，提取時間為2.5h，回流完成后過濾并收集提取液，合并提取液， 得到淡棕色透明液體， 固含量在3%~5%，備用。
1.3.4 組合物對馬拉色菌抑制率的測定
采用懸液定量法測定樣品馬拉色菌抑菌率。取0.1ml 糠秕馬拉色菌（GDMCC2.181）懸浮液，滴入裝有5.0ml PBS 試管內， 回收菌數為1 ×104~9 ×104 cfu/ml，制備馬拉色菌稀釋液，備用。
取5.0ml 試驗樣品原液放入滅菌試管中， 在20℃條件下，恒溫5min。恒溫結束后，將0.1ml馬拉色菌稀釋液加入到試管中，迅速攪勻，并立即計時，作用時間為5min。計時結束后，取0.5ml馬拉色菌和樣品混合液，加入到經滅菌裝有4.5mlPBS 試管中，充分混勻；繼續放置10min 后，吸取樣液1ml 置于滅菌平皿內，每個樣液接種兩個滅菌平皿，向平皿內傾注15ml、40 ~ 45℃的Leeming -Notman 培養基基礎，轉動平皿，使其充分均勻，待Leeming -Notman 培養基基礎凝固后翻轉平皿，在28℃培養7 天后，做活菌菌落計數。以PBS 代替試驗樣品，同時按以上步驟操作，作為對照樣品。實驗重復三次，按照公式①計算平均值。其中，Ⅰ為對照樣品平均菌落數，Ⅱ為試驗樣品平均菌落數。
1.3.5 組合物馬拉色菌抑菌活性優化響應面分析
依據文獻[13 -15]，通過對組合物進行馬拉色菌抑菌活性實驗，以單因素實驗結果為基礎，選取糖脂（A）、迷迭香葉水（B）和側柏葉提取物（C）為考察因素，以抑菌率為響應值，進行三因素三水平響應面法Box -Behnken 設計（Box -Behnken design，BBD），優化組合物的最佳抑菌配比，優化各因素水平見表1。
1.3.6 糖脂協同聯和作用指數（CI）的測定
依據文獻[16]，化合物聯合作用指數分析，采用中效原理計算。按照公式②計算兩化合物聯合作用指數。
其中，D1 為化合物１與別的化合物聯合作用產生Ｘ效應時所需的濃度；D2為化合物2與別的化合物聯合作用產生Ｘ效應時所需的濃度；（DX）1為化合物１單用產生Ｘ效應時所需的濃度；（DX）2為化合物2單用產生Ｘ效應時所需的濃度。
每組實驗重復3 次，求平均值。計算 CI 值，以 CI 值為判定標準， CI ≤0.7 為較強協同作用；0.7< CI＜0.9 為協同作用；0.9＜ CI＜ 1.1 為相加作用；CI＞1.1 為拮抗作用。
1.4 在去屑化妝品中的應用
將A 相預混均勻，加入B 相，攪拌混合均勻，取樣檢測合格后，出料即得頭皮去屑精華液樣品。將配方中的去屑組合物以去離子水代替，按照相同的方法制得頭皮去屑精華液對照樣。配方組成詳見表2。
1.4.1 樣品馬拉色菌抑菌率測試
根據1.2.4 測試馬拉色菌抑菌率的方法，分別測定頭皮去屑精華樣品和對照樣品在不同作用時間內對馬拉色菌抑菌率，以評估產品去屑效果。
1.4.2 人體去屑功效測試
招募志愿者使用上述樣品。入選標準：明顯可見頭皮屑，頭皮油脂分泌旺盛者。排除標準：① 頭部有濕疹、銀屑病、頭癬、石棉樣糠疹或明顯脂溢性皮炎等頭皮皮膚病者；② 30 天內參加藥物臨床試驗或其他試驗者；③ 1 個月內有外用或內服抗真菌藥物或糖皮質激素者。
基本情況：共納入30 例受試者，男女各一半，年齡介于20 ~ 51 歲之間，分2 組，15 人/組，每組男女比例相同，分別使用上述頭皮去屑精華液樣品和對照樣品。使用頻率為每天早晚各使用一次，且不能使用其他頭皮護理產品，也不進行任何頭發美容行為。分別于使用測試產品1、2、3 周和4 周對去屑效果進行評價打分，評級標準如表3 所示。
1.4.3 統計學方法
利用SPSS 27.0 統計軟件進行數據處理分析，組內比較采用配對 t 檢驗，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P<0.05 表示結果具有統計學差異。統計結果通過對馬拉色菌抑制率和頭屑改善情況說明天然去屑組合物的去屑功效。
2、分析和結果
2.1 組合物馬拉色菌抑菌活性優化響應面分析
2.1.1 回歸模型建立
選取馬拉色菌抑菌率（Y）為響應值，Box -Behnken設計（Box -Behnken design，BBD）實驗結果詳見表4。其中-1、0、1 分別代表自變量的低、中、高水平。進一步對回歸模型進行方差分析，結果詳見表5。
在BBD 實驗中組合物對馬拉色菌的抑菌率為89.5% ~98.7%，見表4。采用Design -Expert 10.0.7 軟件進行方差分析結果顯示 F值為187.07，P＜0.0001，詳見表5，證明模型極其顯著且誤差小；失擬項不顯著（P＞0.05），表明殘差源于隨機誤差。決定系數 R2 =0.9959（R2＞0.9 顯示預測值與實測值高度相關），調整后的 R2adj =0.9905，說明模型預測性能優良，各組分對抑菌率的預測與實際結果吻合度高，且兩者間存在顯著關聯性，進一步驗證了模型的有效性。一次項A、B、C 及二次項A2、B2、C2 以及交互項AB、AC 對抑菌率的影響均具有統計學顯著性（P＜0.05），見表5；其中一次項和二次項的影響均為極顯著（P＜0.001），表明因素A、B、C 對抑菌率有顯著的非線性效應。特別是交互項AB、AC 對馬拉色菌抑菌率影響顯著（P＜0.05），說明各因素與響應值間并非簡單的線性關系，而是復雜的非線性聯系。影響馬拉色菌抑菌率因素大小順序為A≈B>C。其中糖脂和迷迭香葉水兩因素相交作用AB 對馬拉色菌抑菌率影響達到極顯著水平（P＜0.0001）。影響馬拉色菌抑菌率因素大小順序為AB＞ AC＞ BC。為了分析變量對馬拉色菌抑菌率的影響，對表5 進行回歸分析，得到關于馬拉色菌抑菌率（Y）二次多項式回歸方程為：Y=98.42+1.65A+0.76B+0.79C-1.87AB+0.52AC+0.1BC-2.89A2-1.76B2-3.41C2
2.1.2 各因素交互作用分析
通過Design -Expert 10.0.7 軟件分析線性回歸方程，可繪制出響應面圖和等高線圖。各因素交互作用對馬拉色菌抑菌率的影響，見圖1。曲線陡峭程度和等高線稀疏密集程度反應了組合物中兩兩因素間相互作用對馬拉色菌抑菌率影響的顯著性。
由圖1a 可知，在迷迭香葉水添加量相同時，隨著糖脂添加量從30g 升高到40g，馬拉色菌抑菌率顯著升高；當添加量超過40g 后， 抑菌率開始下降。由于糖脂具有表面活性，可以提高迷迭香和側柏葉提取物中溶解性較差抑菌組分溶解性，最終形成混合膠束，膠束通過改變馬拉色菌疏水表面，增加植物提取物中溶解性較差的酚類和萜烯類等抑菌組分穿過細胞膜，破壞細胞膜通透性和完整性，引起細胞內容物的滲透，達到抑制馬拉色菌的作用。當超過一定量時，糖脂在水中溶解度降低，從而影響抑菌效果[17-18]。
在糖脂添加量相同時，隨著迷迭香葉水添加量從10g 增加到20g，馬拉色菌抑菌率緩慢升高；當迷迭香葉水添加量超過20g 后，馬拉色菌抑菌率緩慢下降，表明參數之間存在二次函數關系和拮抗作用。在迷迭香葉水添加量超過20g，糖脂添加量超過40g 后，導致馬拉色菌抑菌率迅速下降。
側柏葉提取物和糖脂添加量對馬拉色菌影響見圖1b，當側柏葉提取物添加量在2% ~ 10%，糖脂添加量在30% ~50%時，馬拉色菌抑菌率隨著側柏葉提取物或糖脂添加質量分數升高而呈現先升高后降低的變化趨勢。
側柏葉提取物和迷迭香葉水添加量對馬拉色菌影響見圖1c，當側柏葉提取物添加量在2% ~10%，迷迭香葉水添加量在10% ~30%時，馬拉色菌抑菌率隨著側柏葉提取物或迷迭香葉水添加質量分數升高而呈現先升高后降低的變化趨勢，但側柏葉提取物和迷迭香葉水兩者相互作用的等高線接近圓形，表明交互作用不顯著，對馬拉色菌抑菌率影響不顯著。
采用Design -Expert 10.0.7 軟件進行參數優化，最大限度的提高馬拉色菌抑菌率，得到最佳抑菌條件為糖脂47.29%、迷迭香葉水28.31%、側柏葉提取物8.8%，此條件下抑菌率為95.65%。考慮到實際操作情況，調整糖脂為47%、 迷迭香葉水28%、側柏葉提取物8%，進行三次重復試驗，得到馬拉色菌抑菌率平均值為96.50%，說明該模型具有良好的擬合性。
分別測定最佳抑菌率組合物中47% 糖脂和36%植物提取液（28% 迷迭香葉水+8% 側柏葉提取物）的馬拉色菌抑菌率結果，見圖2。糖脂和植物提取液聯合使用時具有顯著抑制馬拉色菌的作用（P＜0.01）。
2.2 糖脂協同聯合作用指數（CI）的測定
進行糖脂和植物提取液聯合作用指數測定，其中植物提取液組分配比為迷迭香葉水和側柏葉提取物的質量比為28 ∶8。分別測定馬拉色菌抑菌率為50%時，糖脂和植物提取液單獨和聯合使用時，各組分質量濃度，詳見表6。
根據計算公式計算表1 中組分聯合作用指數的CI 值，得出：CI50 =0.4795，可知糖脂和植物提取物按照質量百分比為25.8 ∶12.8 復配時，具有協同抑制馬拉色菌的效果，協同作用較強。
2.3 去屑功效測試
馬拉色菌抑菌率測試結果見圖3 和圖4。未添加去屑組合物的對照組頭皮去屑精華液對馬拉色菌抑制效果微弱，無明顯變化，無抑菌效果；添加去屑組合物的樣品組頭皮去屑精華液，抑制馬拉色菌效果顯著（P＜0.05）。說明添加去屑組合物的頭皮去屑精華具有顯著抑制馬拉色菌作用，具有去屑功效。
人體去屑功效測試結果見圖5 和圖6。通過人體功效評價測試，連續使用頭皮去屑精華液4 周，對照組樣品改善頭屑情況無明顯效果；樣品組頭皮去屑精華液，改善頭屑情況顯著（P＜0.05）。說明添加去屑組合物的頭皮去屑精華液具有改善頭屑、去屑功效。
3、結 論
本文以糖脂、迷迭香葉水、側柏葉提取物為組合物，采用Box -Behnken Design（BBD）響應面優化法，以馬拉色菌抑菌率為衡量指標，得到組合物最佳抑菌配比條件。當糖脂和植物提取液聯合使用時，表現出顯著的協同抑制效應，且協同作用較強。添加去屑組合物的頭皮去屑精華液，在人體去屑功效評價測試中具有良好的去屑效果（P＜0.05）。以糖脂、迷迭香葉水、側柏葉提取物為去屑組合物時，對馬拉色菌協同抑制作用較強，效果較理想，且在頭皮去屑精華液產品中應用達到預期效果，具有實際應用價值，為化妝品行業開發新型、高效、安全的綠色去屑劑提供了有力的數據支持和技術指導。
對于糖脂抑菌性能研究，國內外多數集中于其本身對革蘭陽性菌的抑制效果，目前對馬拉色菌抑制作用尚未報道。與其他物質聯合應用是研究糖脂抑菌性能的新思路，由于目前僅停留在初始研究階段，協同抑制機理尚不明確，仍有許多問題待解決。
引用本文
李丹,陳彩鳳,林星宇,陳殿松,馬鈴.糖脂協同抑制馬拉色菌活性研究及其在化妝品中的應用[J/OL].《化妝品與皮膚科學》網絡專刊,2024(2):16-25[2024-11-22].https://www.cfdam-health.com/ebook/hzp/202402/index.html.
來源：中國食品藥品監管雜志
