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嘉峪檢測網 2025-01-22 09:27
細胞樣本
A 懸浮細胞
短期保存（1~2天）：可以將細胞離心（通常800~1500rpm，離心5min），棄去上清液，然后加入適量的新鮮培養基，重懸細胞后轉移至新的培養瓶或離心管中，放置在細胞培養箱中，保持溫度37℃、5%CO?的環境.
長期保存（數周~數月）：需要進行細胞凍存。
1 首先，收集細胞，離心后棄去上清；
2 用預冷的凍存液（一般含有血清、DMSO等成分，例如可以是90%完全培養基和10%DMSO的混合液或者直接購買商用的細胞凍存液）重懸細胞，調整細胞密度至合適范圍，通常為1×10^6~1×10^7個/mL;
3 將細胞懸液分裝到凍存管中，每管1~2mL;
4 先將凍存管放入程序降溫盒，再置于-80℃冰箱過夜，之后轉移至液氮罐中長期保存。要詳細記錄細胞的名稱、來源、代數、凍存日期等信息，方便后續取用。
B 貼壁細胞
短期保存（1~2天）：更換新鮮的完全培養基，確保培養基的量足夠維持細胞生長，將培養瓶放置在細胞培養箱中，維持正常的培養條件（37℃、5%CO?）。同時，可以在培養基中添加適量的抗生素（如青霉素-鏈霉素溶液，終濃度一般為100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），防止細菌污染。
長期保存（數周~數月）：和懸浮細胞類似，先使用胰酶等消化液將貼壁細胞消化下來，收集細胞后進行離心，然后按照懸浮細胞凍存的方法進行操作。
菌種保存
菌種保存常用的是甘油管凍存法。
其原理是甘油可以作為保護劑，在低溫下防止冰晶的形成，減少冰晶對細胞的機械損傷，同時，超低溫環境（-80℃或液氮）能夠使微生物的代謝活動幾乎停止，極大程度地延長菌種的保存期限。
操作步驟：
配制甘油保存液，一般使用終濃度為15%~50%（體積比）的甘油溶液，例如可以將85mL的培養基或者純水（ddH2O）與15mL的甘油混合，121℃滅菌30min；
將菌種接種到液體培養基中，培養至對數生長期，這時候菌種的活力最強；例如，細菌一般在37℃振蕩培養至對數生長期，通過測定菌液的吸光度（如OD600）來判斷，當OD600達到0.6~0.8左右時，表明菌種處于對數生長期；
在無菌條件下，將等體積的對數生長期的菌液和甘油保存液混合，分裝到無菌的凍存管中，每管1~2mL；
將凍存管放入程序降溫盒中，先在-80℃冰箱過夜，然后轉移到液氮（-196℃）罐中長期保存。
組織樣本
A 新鮮組織（用于生化分析、分子生物學實驗等）
短期保存（1~2天）：將組織樣本放在預冷（4℃左右）的生理鹽水中或組織保存液（如含有抗生素的HBSS緩沖液）中，去除表面的血液、脂肪等雜質。可以把組織樣本放在無菌的容器中，密封后置于4℃冰箱保存。
長期保存（數周~數月）：如果是較大的組織塊，先將其切成小塊（一般體積不超過1cm^3），用凍存液（如含有10%DMSO和20%血清的PBS緩沖液）處理，然后分裝到凍存管中，放入-80℃冰箱或液氮中保存。另外，也可以將組織固定后保存，如使用10%中性福爾馬林溶液固定組織，固定后的組織放在密封容器中，4℃保存，固定液要完全浸沒組織，防止組織干涸或變質。
B 固定組織（用于病理學檢查等）
一般使用福爾馬林、多聚甲醛等固定劑固定組織。固定后的組織如果在假期內不進行后續處理，可以將其轉移至密封良好的容器中，4℃保存。確保固定液完全覆蓋組織，避免組織暴露在空氣中而干燥、變形。同時，要標記好組織的名稱、來源、固定日期等重要信息。
液體樣本
A 全血
短期保存（數小時~1天）：如果是用于檢測血液細胞成分或生化指標，可以將全血收集在含有抗凝劑（如EDTA、肝素等）的采血管中，輕輕顛倒混勻，放在4℃冰箱。
長期保存（數周~數月）：可以離心（3000~5000rpm，離心10~15min）分離出血漿或血清。如果是保存血漿，使用含有抗凝劑（如枸櫞酸鈉、EDTA等）的采血管收集血液，離心后收集上層血漿；如果是保存血清，使用無抗凝劑的采血管，血液自然凝固后離心，收集上層血清。
將血漿或血清分裝到無菌、無RNA酶/DNA酶的凍存管中，每管1~2mL左右，添加適量的保護劑（如0.1%~1%的牛血清白蛋白用于穩定蛋白成分），標記好樣本信息后，放入-80℃冰箱或液氮中保存。然后將其分裝到凍存管中，-80℃保存。
B 血細胞成分（如紅細胞、白細胞、外周血單核細胞（PBMC）等）
離心分離出的血細胞，用生理鹽水洗滌后，可按照細胞樣本的凍存方法進行保存，或者在合適的保存液（如含有葡萄糖、腺嘌呤等成分的紅細胞保存液）中4℃保存。
C 細胞培養上清
若上清液中含有需要檢測的生物活性物質（如細胞因子、分泌蛋白等）用于檢測NO或者ELISA等實驗。
短期保存（1~2天）：可在4℃或者-20℃冰箱放置，但要添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、AEBSF等）防止蛋白降解，添加的終濃度根據抑制劑的種類和實驗要求而定。
長期保存（數周~數月）：需要分裝后-80℃保存。
D 分離的外泌體
短期保存
4℃保存：將含有外泌體的樣本（如細胞培養上清、體液等）收集到無菌的離心管中，密封好后直接放置在4℃冰箱。如果樣本是從細胞培養上清中分離得到的外泌體，最好添加一定量的蛋白酶抑制劑（如PMSF，終濃度一般為1mM）和抗生素（如青霉素-鏈霉素，終濃度為100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），以防止蛋白降解和微生物污染。
-20℃保存：將外泌體樣本轉移至合適的凍存管中，盡量減少樣本中的空氣，防止樣本在冷凍過程中形成冰晶損傷外泌體。可以在樣本中加入適量的保護劑，如0.1%~1%的牛血清白蛋白（BSA），以增加外泌體的穩定性。然后將凍存管放入-20℃冰箱。反復凍融可能會對外泌體造成損傷，所以如果需要再次使用樣本，最好一次性將所需量全部取出。
長期保存
-80℃保存：-80℃是超低溫環境，能夠極大程度地抑制外泌體的酶活性和其他生化反應，有效保存外泌體的結構和功能完整性。操作步驟：收集外泌體樣本，加入適當的保護劑，如含有10%DMSO（二甲基亞砜）和20%胎牛血清（FBS）的PBS緩沖液。將樣本分裝到多個凍存管中，每管體積以1~2mL為宜，這樣便于后續使用，避免反復凍融。將凍存管放入程序降溫盒中，先在-80℃冰箱過夜，使外泌體緩慢降溫，減少冰晶形成。之后，外泌體樣本可以長期保存在-80℃冰箱中。
液氮保存：液氮的溫度極低（約-196℃），因此外泌體的所有生化活動幾乎完全停止，是保存外泌體最理想的長期保存方法。
操作步驟：
1 和-80℃保存類似，先將外泌體樣本用合適的保護劑（如上述含DMSO和FBS的PBS緩沖液）處理并分裝到凍存管中，做好標記；
2 將凍存管放入液氮罐中，注意要保證凍存管完全浸沒在液氮中，并且要定期檢查液氮的量，及時補充，以確保外泌體一直處于低溫環境。
特殊情況保存
固定后保存（用于形態學觀察），例如后期主要關注外泌體的形態結構，可以通過固定可以使外泌體的形態保持不變，便于后續通過電子顯微鏡等手段進行觀察。操作步驟：將含有外泌體的樣本與適量的固定劑（如2.5%戊二醛或4%多聚甲醛）混合，在4℃下固定1~2小時。固定后的樣本可以在4℃下保存數天，或者經過適當的清洗（如用PBS緩沖液清洗3~5次）后，轉移至含有少量緩沖液（如PBS）的容器中，在-20℃或-80℃長期保存，以備后續進行形態學分析。
核酸和蛋白樣本
A 核酸樣本（DNA和RNA）
DNA、質粒DNA樣本等相對穩定，短期（數周）可在4℃保存，長期保存可置于-20℃或-80℃。
RNA樣本容易降解，提取后應立即用無RNase的水溶解，加入適量RNase抑制劑，分裝后-80℃保存。在保存容器上標注樣本名稱、提取日期、濃度等關鍵信息。
B 蛋白樣本
如果是純化后的蛋白，可根據其穩定性，在-20℃或-80℃保存。對于含有蛋白酶的蛋白樣本，需要添加蛋白酶抑制劑后再保存。可以用Bradford法或BCA法等測定蛋白濃度，并記錄下來，方便后續實驗使用。
用于做后續Western Blot實驗的蛋白，在測定蛋白濃度后，可根據比例添加 SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃變性5~10min；短期內使用可分裝后放置-20℃保存，長期保存需要轉移至-80℃。
來源：實驗老司機
