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嘉峪檢測網 2025-04-01 13:13
摘 要： 建立丹酚酸B標準物質研制方法。采用乙醇提取丹參，濃縮后，大孔樹脂凈化，制備液相提純的方式研制丹酚酸B標準物質。采用高效液相色譜法對丹酚酸B標準物質純度進行測定，并進一步通過測定樣品的水分，熾灼殘渣和溶劑殘留的測定，通過質量平衡法和核磁共振法測定樣品中丹酚酸B的含量，最后對定值結果的不確定度進行評估。質量平衡法測得標準品中丹酚酸B的含量為94.63%，擴展不確定度為0.27%，核磁共振法測定結果為95.1%，兩種方法定值結果基本一致。對標準物質的的均勻性和穩定性進行考察，研制得到的丹酚酸B標準物質均勻性良好，穩定性滿足1年要求，能夠滿足丹酚酸B標準物質研制要求。
關鍵詞： 丹酚酸B； 標準物質； 定值； 均勻性； 穩定性； 不確定度
丹酚酸B是由3分子丹參素和1分子咖啡酸縮合而成的，分子結構如圖1所示。丹酚酸B在水中的穩定性較差，加熱條件下容易裂解[1]，通常對抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡、保護大腦和肝臟、抗腫瘤、治療糖尿病和視網膜疾病有著較好的效果[2?4]，是研究較為廣泛的一種丹酚酸類物質。目前市場上所售丹酚酸B標準品種類繁多，但質量層次不齊，這會直接影響到丹酚酸B測量結果的準確性，因此研制丹酚酸B標準物質顯得尤為重要。
圖1 丹酚酸B分子結構圖
Fig. 1 Structure of Salvianolic Acid B
標準物質是一類具有很好特性值，用于校準測量儀器，評價測量方法，給一般物質賦值的材料或者物質[5?6]。標準物質特征量值的準確性取決于標準物質定值方法的準確性，因此需要高精密度、高準確度的分析方法。常用于標準物質定值的方法主要有質量平衡法[7?8]、定量核磁法[9?10]、熱分析法[11?12]和滴定法[13?14]。其中，質量平衡法是基于被測物質主成分與水分、殘留溶劑、無機雜質之和為100%的原理上[15]，通過測定樣品純度、水分、溶劑殘留和熾灼殘渣的含量來計算樣品主成分含量，該方法操作簡單，對實驗條件環境要求低，不受不同物質之間理化性質差異的影響，是一種在標準物質領域常用的定制方法。
筆者采用乙醇提取丹參，濃縮后，經大孔樹脂凈化，制備液相提純的方式研制丹酚酸B標準物質，用質量平衡法和核磁共振法對丹酚酸B進行定值，并對測量結果的不準確度進行評估，保障了丹酚酸B定值結果的準確性和可靠性，并對丹酚酸B的均勻性和穩定性進行考察。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
制備液相色譜儀：NP7010C型，配紫外檢測器，江蘇漢邦科技股份有限公司。
高效液相色譜儀： 1260型，配二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。
電子天平：（1） XPE205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；（2）BSA224S-CW 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。
電熱鼓風干燥箱：DHG-9245A型，上海一恒科學儀器有限公司。
馬弗爐：1100Box Fumace型，美國賽默飛世爾科技公司。
氣相色譜儀：7890B型，配FID檢測器，美國安捷倫科技有限公司。
頂空進樣器：1900型，美國安捷倫科技有限公司。
核磁共振儀：600型，德國布魯克公司。
超純水儀：Synergy UVR型，德國默克公司。
丹酚酸B對照品：質量分數為97.5%，批號為11156-202318，中國食品藥品檢定研究院。
1,4-二硝基苯：質量分數不小于98%，美國西格瑪公司。
AB-8大孔樹脂：孔徑為1 000~250 μm（16～60目），成都艾科達化學試劑有限公司。
丹酚酸B樣品：寶雞翊瑞生物科技有限公司。
甲醇為、乙腈、磷酸、N,N-二甲基亞酰胺，乙酸乙酯：均為色譜純，德國默克公司。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 液相色譜
（1）純度測定。色譜柱： CP-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，三耀精細化工品銷售（北京）有限公司]；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（體積比為22∶78）；柱溫：20 ℃；流量：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm；進樣體積：10 μL。
（2）制備、純化。色譜柱：ODS-2柱（250 mm×20 mm，10 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：純甲醇；流量：10 mL/min；進樣量：5 mL。
1.2.2 氣相色譜
色譜柱： DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；升溫程序：40 ℃保持8 min，然后以10 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持3 min ；載氣：氮氣；流量：1 mL/min；進樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；分流比：1∶10。
1.2.3 頂空進樣
平衡溫度：80 ℃；平衡時間：30 min。
1.3 實驗步驟
1.3.1 標準物質制備
稱取1 kg丹酚酸原料藥材，加入10 L 70%的乙醇，加熱攪拌提取3 h，用快速定性濾紙過濾，取濾液，減壓濃縮至500 mL，加入已活化處理好的AB-8大孔吸附樹脂中，用水淋洗，再用50%乙醇淋洗除雜，用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至乙醇完全除去，用定量濾紙過濾，將溶液注入制備液相色譜儀，按1.2.1中制備液相色譜條件進行分離純化，收集相應的組分，濃縮至浸膏，-40 ℃冷凍干燥后，分裝于200個棕色玻璃瓶中，每瓶100 mg，于-20 ℃冷凍，避光保存。
1.3.2 樣品預處理
（1）質量平衡法。精密稱取丹酚酸B對照品10 mg，分別稱取2份，加甲醇-水混合溶液（80∶100），溶解制成100 μg/mL丹酚酸B對照品溶液。精密稱取2份丹酚酸B樣品25 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液（80∶100）溶解，并定容至標線，制得每1.0 mg/mL溶液，搖勻后，過濾，取續濾液，即得待測樣品溶液。
（2）水分測定。采用《中華人民共和國藥典》2015版四部水分測定法進行測定，精密稱取1 g的丹酚酸B樣品平鋪于以已干燥恒重的扁形稱量瓶中，于105℃恒溫干燥至恒重。
（3）熾灼殘渣測定。采用《中華人民共和國藥典》2015版四部熾灼殘渣檢查法進行測定，精確稱取1～2 g丹酚酸B樣品至已灼燒至恒重的坩堝中，200 ℃緩緩熾灼至完全碳化，放冷至室溫，加入硫酸0.5 mL使其濕潤，低溫加熱至硫酸蒸氣完全除盡后，于750 ℃條件下熾灼使其完全灰化后，移入干燥器內，放冷至室溫，精密稱重，再置于750 ℃條件下熾灼使其達到恒重。
（4）溶劑殘留的測定。根據《中華人民共和國藥典》2015版四部殘留溶劑測定法進行測定。分別精密稱取25 mg甲醇、乙腈、乙酸乙酯于同一100 mL容量瓶中，加DMF稀釋并定容至標線，得到含0.25 mg/mL甲醇、乙腈和乙酸乙酯的溶液。精密稱取丹酚酸B樣品0.2 g于10 mL容量瓶中，加入DMF溶解后定容至標線，搖勻，即得。準確分別移取丹酚酸B對照品溶液和待測樣品溶液各5 mL于2個20 mL頂空瓶中，密封，頂空進樣，進行測定。
（5）核磁共振法。取丹酚酸B樣品20 mg及內標物1,4-二硝基苯10 mg，平行稱取3分，加入2 mL DMSO-d6溶解后，取1 mL樣液加入核磁管中，掃描丹酚酸B與內標物1,4-二硝基苯圖譜。
1.3.3 定量方法
根據質量平衡法計算結果，將丹酚酸B對照品溶液和樣品溶液分別注入液相色譜儀進行測定，以保留時間定性，采用面積歸一化法計算樣品中丹酚酸B的純度。根據水分測定樣品減失的重量計算樣品水分含量。熾灼殘渣測定根據樣品灼燒后剩余的樣品重量計算熾灼殘渣的量。樣品中的溶劑殘留，以色譜峰保留時間定性，計算樣品中甲醇、乙腈、乙酸乙酯的殘留量。
采用樣品含量=樣品色譜純度×(100%-干燥失重-熾灼殘渣量-溶劑殘留量，計算樣品中丹酚酸B的含量。
采用核磁共振法計算結果，采用氫譜，選擇1,4-二硝基苯為內標，經過軟件處理后計算樣品的含量。
1.3.4 均勻性檢查
隨機抽取15個最小包裝單元，每個單元平均抽取3個子樣，每份稱樣量為10 mg，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的甲醇-水溶液，采用高效液相色譜法對純度進行測定，通過F檢驗法對標準物質均勻性進行評價。
1.3.5 穩定性考察
（1）長期穩定性考察。在標準物質儲存后0、1、3、6、8、12個月進行抽樣檢驗，每次抽取2個單元，運用高效液相色譜法對純度進行檢測。
（2）短期穩定性考察。將樣品于20 ℃和40 ℃保存，第0、1、3、5、7 d進行抽樣檢驗，每次抽取2個單元，采用高效液相色譜法對純度進行檢測。
2. 結果與討論
2.1 樣品定值
2.1.1 水分含量
8名實驗室工作人員采用2.3方法對同一批次的丹酚酸B樣品進行水分含量的測定，試驗結果見表1。由表1可知，測定結果的平均值為2.82%，其相對標準偏差為3.47%。
表1 丹酚酸B樣品水分測定結果
Tab. 1 Result of moisture content ( % )
2.1.2 熾灼殘渣
選擇實驗室8名工作人員，按2.4方法對同一批次丹酚酸B樣品進行熾灼殘渣量的測定，8個獨立平行結果見表2。由表2可知，平均熾灼殘渣量為0.141%，測定結果的相對標準偏差為1.71%，客觀的反映了丹酚酸B樣品中無機雜質的殘留量。
表2 丹酚酸B樣品熾灼殘渣
Tab. 2 Burning residue of sample B of salvianolic acid ( % )
2.1.3 溶劑殘留
選取8名實驗室工作人員，按照2.5方法對同一批次丹酚酸B制備過程中使用到的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的殘留量進行測定，試驗結果見表3。
表3 丹酚酸B樣品溶劑殘留
Tab. 3 Residual solvent in sample B of salvianolic acid ( % )
由表3可知，8名實驗人員測得同一批次丹酚酸B樣品中乙腈的殘留量均為0，表明乙腈未被檢出，但卻在樣品中發現了甲醇和乙酸乙酯的殘留。8名實驗人員測得甲醇殘留量平均結果為0.194%，測定結果的相對標準偏差為4.08%；乙酸乙酯殘留量的平均結果為1.19%，測定結果的相對標準偏差為6.36%，該方法的準確度符合要求。
2.1.4 純度測定
8名實驗室工作人員分別采用Aglient1260型液相色譜儀（儀器1）、U3000型液相色譜儀（儀器2），按照2.2方法和色譜條件對同一批批丹酚酸B樣品進行純度分析，丹酚酸B樣品色譜圖見圖2。由圖2可知，丹酚酸B樣品中有其他雜質峰的檢出，因此采用面積歸一化法計算樣品的純度。
圖2 丹酚酸B液相色譜圖
Fig. 2 HPLC chromatogram of Salvianolic Acid B
在研究工作中，采用高效液相色譜法測定樣品的純度，并采用不同的實驗人員和不同型號的儀器進行對比，丹酚酸B樣品純度測定結果見表4。由表4可知，不同實驗人員不同型號的儀器測定結果較為接近，證明樣品的純度測定結果較為準確可靠。8名實驗人員分別采用儀器1、儀器2測得樣品純度（質量分數）平均值分別為98.92%、98.98%，測定結果的相對標準偏差分別為0.32%、0.21%，表明8名實驗人員的結果較為一致，且兩種儀器測定結果基本一致，客觀地反映了樣品純度的真實情況。
表4 丹酚酸B樣品純度測定結果表
Tab. 4 Result of Purity of samples ( % )
2.1.5 樣品含量
根據質量平衡法計算樣品中丹酚酸B、水分、溶劑殘留、無機雜質以及樣品中主成分的含量之和應該等于1。樣品含量=樣品色譜純度×(100%-干燥失重-熾灼殘渣量-溶劑殘留量)= 98.92%×(100%- 2.82%-0.14%-0.19%-1.19%)=94.63%。
質量平衡法計算丹酚酸B樣品中丹酚酸B的含量，操作過程如2.1.1~2.1.4中所述，操作過程簡單，需要的儀器設備簡單，對實驗條件和環境要求較低，易于實現。雖然測定過程涉及到純度，干燥失重，熾灼殘渣以及殘留溶劑等多個環節步驟的測定，但從試驗結果來看，多個人員測定樣品的純度，干燥失重，熾灼殘渣和溶劑殘留的結果來看，結果較為接近，精密度和準確度都較好，樣品含量測定的可靠性較高，可以作為標準品定值的常用方法。
2.1.6 不確定度
通過2.1.1~2.1.4中測定樣品純度、干燥失重、熾灼殘渣、溶劑殘留的8組測量結果，根據格拉布斯準則，進行可疑值判斷，顯示結果無可疑值后，計算得到合成標準不確定度[16?17]：Uc（c）= c×{
}1/2 = 0.11 4%。其中，c為樣品含量，Uc（P）為樣品純度的不確定度，P為樣品純度，Uc（M）為干燥失重不確定度，Uc（A）為熾灼殘渣的不確定度，Uc（J）為甲醇殘留的不確定度，Uc（E）為乙酸乙酯殘留量的不確定度，M為干燥失重量，A為熾灼殘渣量，J為甲醇殘留量，E為乙酸乙酯殘留量。
擴展不確定度為U=Uc（c）×k；k為包含因子，置信概率P=0.95，自由度n=8-1=7，查t分布表，得到k=2.36，因此由質量平衡法測得丹酚酸B含量得擴展不確定度為U=2.36×0.001 14=0.0 0269。由質量平衡法計算得到樣品中丹酚酸B的含量為94.63%，擴展不確定度為0.269%。
2.1.7 核磁共振定值結果分析
根據掃描得到的丹酚酸B和內標物1,4-二硝基苯的核磁共振譜圖見圖3。
圖3 丹酚酸B和內標物1，4-二硝基苯核磁共振圖
Fig. 3 NMR spectra of salvianolic acid B and internal standard 1，4-dinitrobenzene
選擇內標物1,4-二硝基苯特征峰δ 8.40作為內標定量峰，目標物丹酚酸B特征峰δ 5.70為丹酚酸B定量峰，計算丹酚酸B含量，測定結果見表5。由表5可知，測定結果的相對標準偏差為0.8%，核磁共振定值法測得丹酚酸B樣品平均含量為95.1%，與質量平衡法測得結果（94.6%）基本一致，雖然質量平衡法測定標準品純度涉及多個測定環節，但操作較為簡單，在一般的分析實驗室較為容易實現，結果準確可靠。
表5 丹酚酸B樣品純度測定結果（核磁共振法）
Tab. 5 Result of Purity of samples（NMR） ( % )
2.2 均勻性檢驗
采用高效液相色譜進行測定，隨機抽取15個最小包裝單元，每個單元抽取3個字樣，每份稱樣量為10 mg，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的甲醇-水溶液，用高效液相法測定其純度測定結果見表6。
表6 丹酚酸B均勻性測定結果
Tab. 6 Result of homogeneity of samples
由表6可知，平均質量分數為99.09%，平均偏差s=0.017，組間方差S12=0.000 317，組內方差S22=0.000 201，F=1.58，查表得F0.05（14，30）=2.04，F＜F0.05（14，30），表明樣品均勻性良好。
2.3 穩定性檢驗
在標準物質儲存后0、1、3、6、8、12個月進行抽樣檢驗，每次抽取2個單元，每份稱樣量為10 mg，配制成濃度為0.1 mg/mL的甲醇水溶液，按照1.3.5方法進行長期穩定性考察。其測定結果最大值為99.21%，最小值為98.69%，樣品純度變化不明顯，說明樣品在標準儲存條件下12個月內穩定性良好。將樣品儲存在20 ℃和40 ℃保存，第0、1、3、5、7 d進行抽樣檢驗，每次抽取2個單元，每份稱樣量為10 mg，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的甲醇水溶液，按照1.3.5方法進行長期穩定性考察。其測定結果最大值為99.27%，最小值為98.76%，樣品純度變化不明顯，說明樣品在短期運輸條件下7 d內穩定性良好。
3. 結語
研制了丹酚酸B標準物質，運用質量平衡法和核磁共振法對其定值進行研究，對測量結果的不確定度進行評估，并對研制標準物質的均勻性和穩定性進行考察。結果表明，研究所用樣品中丹酚酸B的含量為94.63%，擴展不確定度為0.27%。核磁共振定值結果為95.1%，與質量平衡法定值結果一致，制得丹酚酸B標準物質均勻性良好，穩定性良好，該方法可用于丹酚酸B標準物質的制備。
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引用本文： 林芳，趙俊楠，呂卓，等 . 丹酚酸B標準物質研制［J］. 化學分析計量，2024，33（12）： 1. (LIN Fang, ZHAO Junnan, LYU Zhuo, et al. Develoment of salvianolic acid B purity reference material[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 1.)
來源：化學分析計量
