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代謝組學(xué)已經(jīng)成為當(dāng)今生物與醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點，其作為系統(tǒng)生物學(xué)的核心組學(xué)，與其他組學(xué)進行的系統(tǒng)性研究為中藥作用機制研究提供了思路和方法[1]。代謝組學(xué)已經(jīng)在臨床疾病診斷及重大疾病的早期診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在代謝組學(xué)研究中最常采用的技術(shù)為核磁共振（NMR, nuclear magnetic resonance）[2]和質(zhì)譜（MS, mass spectrometry）[3]分析技術(shù)。往往在實際應(yīng)用中色譜分離技術(shù)，如氣質(zhì)(gas chromatography, GC)、液相(liquid chromatography, LC)和毛細(xì)管電泳（capillary elctrophoresis, CE)，它們常與質(zhì)譜串聯(lián)起來分析。

圖1 三種分析方法策略流程圖

基于氣相色譜和液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析策略主要有（圖1）：目標(biāo)化合物分析方法（Target analysis）、非目標(biāo)化合物分析方法（Un-target analysis）和可疑化合物分析方法（Suspect analysis）[4]。

利用非目標(biāo)化合物分析方法篩選結(jié)果可以擴展和精煉目標(biāo)化合物分析方法所研究的對象[5]。對于采集的數(shù)據(jù)包含的信息往往都比較龐雜，數(shù)據(jù)預(yù)處理過程和數(shù)據(jù)分析是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，這將直接影響到最終數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。數(shù)據(jù)預(yù)處理過程中使用的軟件大致分為商品化軟件（如Markerlynx、MassHunter、AMDIS和ChromaTOF）和免費的軟件（如Mzmine[6, 7]，XCMS[8-10]，MSFACTS[11]和MetAlign[12]等）兩大類，它們可以將原始數(shù)據(jù)進行峰去卷積、標(biāo)準(zhǔn)化和峰對齊等處理。

緊接著，代謝組學(xué)中常采用的多元統(tǒng)計分析，能夠?qū)嫶蟮臄?shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)樣品之間或各組之間的異同[13]。無監(jiān)督模式下的PCA和有監(jiān)督模式下的OPLS-DA均是代謝組學(xué)分析常使用的一種分類方法[14, 15]。比如我們以中藥黃芩為例，運用非靶向代謝組學(xué)手段結(jié)合Q exactive MS分析方法研究不同規(guī)格黃芩（枯芩和子芩）樣品之間差異性的活性成分，研究思路如圖2所示。

圖2 基于代謝組學(xué)的研究方法應(yīng)用于中藥黃芩[16]

以中藥材為例，樣品的制備應(yīng)根據(jù)樣品自身的特性，優(yōu)選最佳的提取方法（如超聲提取、回流提取等）和溶劑。常用的提取溶劑為水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等。

注意事項：前期樣品制備方法可以采用單因素或正交實驗進行條件優(yōu)化；如果采用超聲提取，應(yīng)客觀評判超聲功率和超聲時間引起水浴溫度升高對提取樣品的影響；應(yīng)該充分評價提取樣品所帶來的操作誤差對實驗結(jié)果的影響。

生物樣品主要包括體液（全血、血漿、血清、尿液、唾液和腦脊液等）、組織（腦、心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胰腺、小腸、大腸、肌肉和骨骼等）以及其它（毛發(fā)和糞便等）樣品。不同類型樣品前處理方式有所不同。常見的生物樣品前處理方法：包括蛋白沉淀（PP）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）法。

注意事項：應(yīng)充分評價提取樣品所帶來的操作誤差對實驗結(jié)果的影響，有必要需設(shè)定質(zhì)控樣品；需考慮樣品收集過程中穩(wěn)定性問題，如尿液樣品的收集，基質(zhì)中酶、光照及溫度對樣品的影響；需考慮樣品前處理過程中吸附性問題，如腦脊液（CSF）和尿液中因為蛋白含量較低，較易與樣品收集管由于表面電荷產(chǎn)生相互吸附以及質(zhì)控樣品制備問題。

目前，對于LC/GC-MS采集的數(shù)據(jù)進行預(yù)處理的軟件非常之多，有免費開源的（如XCMS，MZmine和MetAlign等）、商業(yè)收費的（Markerlynx，MassHunter，ChromaTOF和ChemPattern 2.0等）和自主開發(fā)設(shè)計的編程軟件（如Metlab）。每一種軟件都有各自的優(yōu)缺點，需要按照自己的目的或需求進行選擇。其中，XCMS是一個免費的R軟件包，可用于LC/MS或GC/MS數(shù)據(jù)處理，是目前使用最為廣泛，引用文獻最多的一個軟件[17]。XCMS online）（圖3）是基于云計算的在線版本（https://xcmsonline.scripps.edu/），不需要下載安裝，允許用戶在線上傳LC/MS或GC/MS數(shù)據(jù)（格式如NetCDF，mzXML和mzData等），如按照自定義選項設(shè)置相關(guān)參數(shù)后，就可在線查看和分析結(jié)果[8-10, 18]。

對預(yù)處理后數(shù)據(jù)采用Excel的COUNTIF函數(shù)對原始數(shù)據(jù)進行篩選去除零，除零原則根據(jù)自身要求而定，常用80-20原則，即保留樣品中含有20%以下為零的數(shù)據(jù)。然后進行多元統(tǒng)計分析（如PCA和OPLS-DA）得到VIP（≥1）值表，采用Excel的VLOOKUP函數(shù)對找到的VIP值≥1的數(shù)據(jù)和原始數(shù)據(jù)進行匹配，并列出每一個m/z下的原始數(shù)據(jù)信息，以便于甄選。

圖3 XCMS Online軟件界面

代謝組學(xué)中運用的多元統(tǒng)計分析方法主要包括無監(jiān)督分析（unsupervised analysis）方法（如PCA，HCA）和有監(jiān)督分析（supervised analysis）方法（如PLS，PLS-DA，OPLS，和OPLS-DA）。無監(jiān)督分析方法是指所有樣品不加以區(qū)分，每個樣品都對模型有著同樣的貢獻。對于組間差異較大，而組內(nèi)差異較小時，無監(jiān)督分析方法可以明顯區(qū)分組間差異。反之，組間差異不明顯，而組內(nèi)差異較大，無監(jiān)督模式就難以發(fā)現(xiàn)和區(qū)分組間差異。原因在于，無監(jiān)督分析方法不能忽略組內(nèi)誤差，消除與研究目的無關(guān)的隨機誤差，過于關(guān)注于局部或細(xì)節(jié)，忽略對象的整體及其規(guī)律，因此，不利于發(fā)現(xiàn)組間差異和差異性化合物，而這正是代謝組學(xué)研究最重要的目的。

于是乎有監(jiān)督分析方法這類新的分析技術(shù)應(yīng)運而生，能夠很好地解決上述存在的問題。原因是其先將檢測樣品進行分類區(qū)分，再進行分析，這樣在計算時就忽略樣品間組內(nèi)隨機差異，突出組間系統(tǒng)差異[13]。目前代謝組學(xué)研究評價中應(yīng)用最為常用的模式識別方法主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），如圖4所示。OPLS-DA為PLS-DA的改進方法，濾掉與類別判斷不相關(guān)的變量信息，提高模型判別的準(zhǔn)確性。采用的多元統(tǒng)計軟件為SIMCA P。

圖4 典型的PCA（A和D）、OPLS-DA（B和E）和S-Plot（C和F）圖[16]

OPLS-DA模型概述圖中R2Y（cum）表示模型每次進行分類后對所有因變量Y變化進行說明部分；Q2（cum）表示可以通過模型的交叉驗證進行預(yù)測因變量Y變化的部分。R2Y（cum）和Q2（cum）接近1.0說明模型建立完美。PCA和OPLS-DA模型下，我們常根據(jù)實際情況采用UV、Par和Ctr三種標(biāo)度化類型（表1）。

表1 不同類型標(biāo)度化（Scaling type）及其定義

非靶標(biāo)化合物分析方法基本流程為樣品前處理的選擇和優(yōu)化、儀器分析（全掃描）、數(shù)據(jù)處理（預(yù)處理、多元統(tǒng)計分析）、目標(biāo)化合物的二級圖譜掃描、結(jié)構(gòu)指認(rèn)[5]。各廠家的高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）類型主要有Q-TOF，IT-TOF和Orbitrap等系列。其中，如Q Exactive MS是新型四級桿和軌道阱雜交HRMS，在分辨率、掃描速度和靈敏度性能上進一步提升，Q Exactive質(zhì)譜儀能進行高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物的篩選[19]。

表2 數(shù)據(jù)解析參考數(shù)據(jù)庫信息

根據(jù)目標(biāo)差異性成分MS數(shù)據(jù)進行MS/MS掃描，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫（常用的數(shù)據(jù)庫如表2所示）和文獻報道（比如黃酮類成分黃酮苷元、氧苷和碳苷的裂解規(guī)律，如圖5所示）對這些成分進行結(jié)構(gòu)解析。

圖5 黃酮類成分ESI模式下常見的裂解規(guī)律[16]

顯然，接下來我們面臨的挑戰(zhàn)是對于找到的這些差異成分是否具有生物活性呢？是否能夠具有代表性？為此，我們需要一方面通過文獻查證，對體內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的差異性成分的生物活性進行追蹤；另一方面，需要進行不同批次樣品給藥的重復(fù)驗證實驗，個人推薦至少開展六個批次樣品給藥實驗，以證明發(fā)現(xiàn)的含量差異性標(biāo)志物的穩(wěn)定性和可靠性。同時，可以采用直接購買相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，或自己分離制備，亦或自己合成等途徑開展離體活性實驗是一種很好的選擇，比如常見的LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型，腫瘤細(xì)胞抑制實驗等，并結(jié)合Western Blot，ELISA和RT-PCR實驗進行表征。最后，所有的結(jié)果需要通過體內(nèi)實驗，運用藥動學(xué)（PK）和藥效學(xué)（PD）相關(guān)實驗進行驗證。

注意事項：所有的實驗方案均需考慮給藥劑量的選擇、及其與陽性藥的可比性、實驗對照組設(shè)定的合理性和藥物濃度依賴性等因素。

對于一個復(fù)雜體系來說，基于組學(xué)的方法不失為一種較為準(zhǔn)確和精確的方法去鑒別體系中含有的活性成分或Biomarker。采用該方法主是以藥物在靶器官或體液中的含量或濃度分布是藥物發(fā)揮藥效為前提條件。當(dāng)然，藥物起效的途徑并不局限于此。以中藥的多組分體系為例，如王廣基院士提出的“腦病外治”的作用機理[20]，其指出人參皂苷不直接進入腦內(nèi)發(fā)揮作用，而是通過抑制外周犬尿氨酸的水平，減少進入腦內(nèi)的犬尿氨酸，阻斷外周炎癥向腦部的傳遞，發(fā)揮腦神經(jīng)保護作用。

蔡少青教授提出中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式”新概念及“疊加作用”新假說[21]：中藥藥效物質(zhì)顯效形式的集合或疊加是藥效的核心物質(zhì)基礎(chǔ)，各個顯效形式的血藥濃度的疊加作用是藥效作用機制之一。該方法能夠較為完整地呈現(xiàn)體外復(fù)雜體系中化學(xué)成分的輪廓，同時又能夠較好地發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分的吸收、分布和代謝差異。又如劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Markers）的新概念[22]，基于此我們可以嘗試由體內(nèi)代表性差異成分去建立對體外藥材的質(zhì)量評價和控制的質(zhì)量成分群，擬為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供數(shù)據(jù)支持。