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作者：劉春雨 , 于傳飛 , 崔永霏 , 武剛 , 黃璟 , 王蘭       

中國(guó)食品藥品檢定研究院, 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102629

摘要：

目的: 利用AlphaLISA方法建立抗白介素-17受體單抗的生物學(xué)活性測(cè)定方法。方法: 以人包皮成纖維細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，通過(guò)AlphaLISA檢測(cè)系統(tǒng)建立抗IL-17R單抗的生物學(xué)活性測(cè)定方法，根據(jù)四參數(shù)擬合分析計(jì)算抗IL-17R單抗的相對(duì)效價(jià)，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果: 抗IL-17R單抗在該方法中存在量效關(guān)系，并且符合四參數(shù)方程：y=（A-D）/[1+（x/C）B]+D。6批抗IL-17R單抗經(jīng)3次測(cè)定，相對(duì)效價(jià)平均值在（84.93±3.12）%~（107.51±1.66）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。2批回收率樣品經(jīng)3次測(cè)定，回收率分別為（100.66±13.65）%和（115.69±3.85）%。結(jié)論: 本研究利用AlphaLISA方法在國(guó)內(nèi)首次成功建立重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高的抗IL-17R單抗的生物學(xué)活性測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：抗IL-17R單抗    單克隆抗體    生物學(xué)活性    AlphaLISA法    

白介素-17(Interleukin-17, IL-17)是由屬于T細(xì)胞亞群的Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的, 在嚙齒類T細(xì)胞雜交篩選試驗(yàn)中首次被鑒別出來(lái), 最早被命名為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原8(Cytotoxic T-lymphocyte-associated Antigen 8, CTLA-8)[1]。IL-17家族目前已有六種蛋白, 分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。而IL-17的受體為IL-17R(Interleukin-17 Receptor, IL-17R), 同樣存在幾種同源蛋白, 分別為IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL17RE[2]。人源IL-17A以同源二聚體或與IL-17F形成異源二聚體的形式存在。IL-17A、IL-17F以及IL-17A/F的受體都是IL-17RA和IL-17RC形成的異源二聚體。IL-17與IL-17R特異性結(jié)合, 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活以及IL-8的分泌, 共同促進(jìn)T細(xì)胞的增殖并與炎癥反應(yīng)相關(guān)[3]。還能誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor α, TNF-α)、IL-8、IL-1β、生長(zhǎng)相關(guān)的癌基因-α(Growth Related Oncogene, GRO-α)等多種細(xì)胞因子的表達(dá)[4-6]。IL-17在宿主抵御各種微生物感染中起了重要作用, 如復(fù)發(fā)性葡萄球菌感染和粘膜皮膚念珠菌病等[7-8]。

IL-17A信號(hào)通路與各種自身免疫病包括銀屑病(Psoriasis, Ps)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎(Psoriaticarthritis, PsA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)等均有一定的關(guān)聯(lián)[9-13]。以IL-17及IL-17R為靶點(diǎn)的單抗, 可以靶向性特異結(jié)合于其配體, 達(dá)到阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用, 從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生, 主要用于銀屑病等自身免疫疾病的治療[14-15]。

Alpha技術(shù), 即放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測(cè)(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay, Alpha), 是一種以微珠為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù), 包括供體微珠(Donor Beads)和受體微珠(Acceptor Beads)。結(jié)合于供體微珠上的分子(分子A)與結(jié)合于受體微珠上的分子(分子B)發(fā)生相互作用, 當(dāng)兩個(gè)微珠達(dá)到足夠接近的狀態(tài)時(shí), 能夠檢測(cè)出發(fā)光信號(hào)。供體微珠表面的光敏劑經(jīng)激光照射而受到激發(fā), 將周圍的氧轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的單線態(tài)氧。單線態(tài)氧向供體微珠周圍擴(kuò)散, 到達(dá)附近的受體微珠后可在微珠內(nèi)引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng), 并最終發(fā)射出光。反之, 如果各微珠上的分子A與分子B不發(fā)生相互作用, 則供體微珠產(chǎn)生的單線態(tài)氧不會(huì)到達(dá)受體微珠, 則不會(huì)引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng), 見(jiàn)圖 1。

圖 1 AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)原理

受體微珠根據(jù)不同染料, 其檢測(cè)波長(zhǎng)也不同, AlphaLISA受體微珠標(biāo)記銪(Eu), 其發(fā)射波長(zhǎng)為615~623 nm, 適用于緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液樣品[16-17]。具有親和性強(qiáng), 背景值低、靈敏度高的特點(diǎn)。

本文利用AlphaLISA技術(shù), 以HFF-1細(xì)胞為靶細(xì)胞, 在國(guó)內(nèi)首次建立了準(zhǔn)確、快速的抗IL-17R抗體的生物學(xué)活性測(cè)定方法。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

HFF-1細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室留存(ATCC, SCRC-1041);抗IL-17R單抗參比品和供試品均為本實(shí)驗(yàn)室留樣; IL-17A購(gòu)自Amgen公司; 胎牛血清(FBS)、胰酶(Trypsin)、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自GIBCO公司; AlphaLISA IL-8試劑盒購(gòu)自PE公司。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀(Perkin Elmer公司); SoftMax分析軟件(Molecular Devices公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 生物學(xué)活性檢測(cè)原理

HFF-1細(xì)胞系是人包皮成纖維細(xì)胞系(Human Foreskin Fibroblast, HFF-1), 可穩(wěn)定表達(dá)IL17R, 位于細(xì)胞表面的IL-17R與IL-17A結(jié)合后, 激活細(xì)胞并將IL-8分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清中, 見(jiàn)圖 2。IL-8則通過(guò)AlphaLISA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)[13, 17]。IL-8將AlphaLISA抗IL-8受體微珠與鏈親和素-生物素化的抗IL-8供體微珠橋聯(lián)起來(lái)形成供體受體復(fù)合物。該復(fù)合物接受激光照射后, 可激發(fā)能量釋放出AlphaLISA信號(hào), 信號(hào)強(qiáng)度劑量依賴性與IL-8劑量成正比, 與抗IL-17R單抗劑量成反比。

  圖 2 抗IL-17R單抗生物學(xué)活性檢測(cè)原理  

1.3.2 抗IL-17R單抗的生物學(xué)活性測(cè)定

HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 加入0.25%EDTA的胰酶, 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化1~2 min, 加入5 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)終止消化, 200 g離心5 min后以含0.1 % FBS的DMEM培養(yǎng)基(稀釋液)重懸細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞濃度至8×104個(gè)·mL-1, 以每孔100 μL接種于96孔白板中, 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~3 h; 以含有600 ng·mL-1 IL-17A的稀釋液將抗IL-17R單抗及參比品稀釋至起始濃度為3000 ng·mL-1, 再以稀釋液按照1:2.5的比例往下稀釋, 共10個(gè)稀釋度, 每個(gè)稀釋度設(shè)雙復(fù)孔, 將稀釋后的抗IL-17R單抗轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔50 μL, 細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜(16~20 h); 次日進(jìn)行AlphaLISA檢測(cè):以AlphaLISA工作緩沖液稀釋生物素化抗IL-8抗體和AlphaLISA抗IL-8受體微珠, 加入測(cè)定用96孔白色半孔板, 每孔20μL, 使半孔板中生物素化抗IL-8抗體的終濃度為2.5 nmol·L-1、AlphaLISA抗IL-8受體微珠的終濃度為25 μg·mL-1;將細(xì)胞培養(yǎng)板取出, 270 g離心10 min后細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)入測(cè)定用96孔白色半孔板, 每孔20μL, 避光室溫孵育50~75 min; 以AlphaLISA工作緩沖液稀釋鏈親和素標(biāo)記的供體微珠, 加入測(cè)定用96孔白色半孔板, 每孔20μL, 使半孔板中鏈親和素-生物素化的抗IL-8供體微珠終濃度為40μg·mL-1, 室溫避光孵育25~40 min; 設(shè)置起始照射光波長(zhǎng)為680 nm, 化學(xué)發(fā)光信號(hào)波長(zhǎng)為615 nm, 讀取AlphaLISA信號(hào)值(AlphaLISA Signal); 利用SoftMax軟件分析數(shù)據(jù), 以抗IL-17R單抗?jié)舛葘?duì)數(shù)為x軸, 對(duì)應(yīng)的AlphaLISA信號(hào)值為y軸, 選用四參數(shù)方程回歸模型, 擬合劑量效應(yīng)曲線, 得到曲線的半數(shù)有效濃度(50 Percent of Effective Concentration, EC50), 按照下述公式計(jì)算供試品的相對(duì)效價(jià)。

1.3.3 抗IL-17R單抗生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.3.1 精密性試驗(yàn)

分別測(cè)定6批供試品的生物學(xué)活性, 每批重復(fù)測(cè)定3次, 計(jì)算RSD, 驗(yàn)證該方法的精密性。

1.3.3.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

將2批供試品與參比品等體積混合制備回收率樣品, 測(cè)定其生物學(xué)活性, 每批重復(fù)測(cè)定3次, 按下述公式計(jì)算回收率, 驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 抗IL-17R生物學(xué)活性劑量效應(yīng)曲線

以抗IL-17R單抗?jié)舛葹閤軸, 對(duì)應(yīng)的AlphaLISA信號(hào)值為y軸, 選用四參數(shù)方程回歸模型, 擬合抗IL-17R單抗的劑量效應(yīng)曲線。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SoftMax軟件分析, 符合四參數(shù)方程式:y=（A-D）/[1+（x/C）B]+D, 在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸上呈典型的反S型曲線, R2 >0.99, 見(jiàn)圖 3。抗IL-17R單抗劑量效應(yīng)曲線上參比品及供試品的EC50分別為3.78 ng·mL-1和3.69 ng·mL-1。

圖 3 抗IL-17R單抗生物學(xué)活性的劑量效應(yīng)曲線

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 精密性

同時(shí)檢測(cè)6批抗IL-17R單抗與參比品, 每批進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定, 計(jì)算相對(duì)效價(jià), 結(jié)果顯示6批抗IL-17R單抗的相對(duì)效價(jià)平均值在(84.93± 3.12)% ~(107.51±1.66)%, RSD均小于5 %, 結(jié)果見(jiàn)表 1。

表 1 抗IL-17R單抗生物學(xué)活性精密性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 準(zhǔn)確性

將2批供試品與參比品等體積混合制備回收率樣品, 測(cè)定其生物學(xué)活性, 分別重復(fù)測(cè)定3次, 2批回收率樣品的回收率分別為(100.66 ± 13.65)%和(115.69 ± 3.85)%, RSD均小于15 %, 見(jiàn)表 2。

表 2 抗IL-17R單抗生物學(xué)活性準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

治療性單克隆抗體的生物學(xué)活性是其效應(yīng)發(fā)揮的最關(guān)鍵條件, 也是評(píng)價(jià)其有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(Critical Quality Attribute, CQA)。以IL-17/IL17R為靶點(diǎn)的單抗藥物, 因其在銀屑病等自身免疫性疾病的療效, 已成為近年來(lái)比較值得關(guān)注的新藥之一。

目前, 抗IL-17/IL-17R單抗質(zhì)量控制中的生物學(xué)活性測(cè)定方法有基于檢測(cè)GROα、IL-6等細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞酶免法、基于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞技術(shù)的活性檢測(cè)方法以及基于AlphaLISA技術(shù)的活性檢測(cè)方法。而AlphaLISA方法已經(jīng)成為繼放射免疫、酶標(biāo)免疫、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光之后的一種新型檢測(cè)方法, 它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 越來(lái)越受到各領(lǐng)域科研工作者的關(guān)注。AlphaLISA無(wú)需分離和洗滌步驟, 操作簡(jiǎn)便, 不同于FRET檢測(cè), 單線態(tài)氧的擴(kuò)散距離可達(dá)到200 nm, 最大程度減少了供體/受體之間的距離和方向限制。因此, 可用于全長(zhǎng)蛋白檢測(cè)和使用抗體的夾心免疫測(cè)定等應(yīng)用。

本試驗(yàn)利用IL-8的AlphaLISA檢測(cè)方法, 將系列稀釋的抗IL-17R單抗與IL-17A結(jié)合后培養(yǎng)過(guò)夜, 通過(guò)AlphaLISA方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中釋放的IL-8進(jìn)行定量檢測(cè), 通過(guò)四參數(shù)方程擬合, 測(cè)得抗IL-17R單抗EC50, EC50值越低, 活性越高, 通過(guò)參比品與供試品EC50值的比較, 計(jì)算供試品的相對(duì)效價(jià)。抗IL-17R單抗經(jīng)1:2.5倍系列稀釋后可以得到較好的反S型曲線, 6批抗IL-17R單抗經(jīng)三次測(cè)定相對(duì)效價(jià)的平均值在84.93%~107.51%, RSD均小于15%。該方法基于藥物作用機(jī)制(Mechanism of Assay, MOA), 操作簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確客觀、重復(fù)性好。為同類治療性抗體或相關(guān)制品的生物學(xué)活性質(zhì)量控制奠定了一定基礎(chǔ)。

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