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幾乎任何HPLC方法優(yōu)化的目的都是追求在最短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最大的分離。這種優(yōu)化可以讓我們獲得更好的數(shù)據(jù)，也讓分析的運(yùn)行成本和耗費(fèi)時(shí)間更低。為了達(dá)到這個(gè)目的，色譜工作者需要基于對(duì)HPLC基礎(chǔ)知識(shí)的理解快速設(shè)計(jì)方法。如下三個(gè)建議可以為HPLC方法的開(kāi)發(fā)提供一個(gè)好的起點(diǎn)。

1. 考慮分析物的化學(xué)性質(zhì)

分析物通過(guò)與HPLC固定相和流動(dòng)相的相互作用而實(shí)現(xiàn)保留，如果沒(méi)有這些相互作用，就不會(huì)實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)。因此，你的分析物的化學(xué)性質(zhì)會(huì)影響到你方法開(kāi)發(fā)的全過(guò)程，包括色譜柱選擇和流動(dòng)相設(shè)計(jì)。特別重要的是你的分析物的極性，比如純粹的非極性分析物適合在反相HPLC模式下選擇疏水性固定相（如C18，C8和phenyl等）來(lái)保留和分離；極性或者可離子化的分析物需要更極性的固定相，比如氰基或者氨基，或者甚至選擇一種不同的色譜模式，比如親水作用色譜（HILIC），正相或者混合模式來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。對(duì)于可離子化的分析物，當(dāng)它們處于電離狀態(tài)時(shí)是很難用常用的反相HPLC來(lái)保留的，因此很有必要調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值而使這些化合物呈中性狀態(tài)來(lái)獲得更好的保留以及避免峰形問(wèn)題（比如堿性化合物的拖尾）。在設(shè)計(jì)流動(dòng)相時(shí)，獲取分析物的pKa方面的信息是極其重要的，流動(dòng)相的pH應(yīng)該比分析物的pKa高或者低2個(gè)單位（取決于分析物是酸性還是堿性，對(duì)于酸性是低2個(gè)單位，對(duì)于堿性化合物是高2個(gè)單位）以使分析物呈中性。篩選一定范圍的pH并評(píng)估它對(duì)保留和分離的影響是非常有效的操作。

2. 優(yōu)化選擇性

在所有影響分離度的色譜參數(shù)中，選擇性是影響最大的因素（如圖1）。每個(gè)因素（選擇性，保留率，柱效）都能通過(guò)改變特定的方法的參數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)，比如流動(dòng)相組成，溫度或者柱內(nèi)徑。然而，色譜柱固定相是影響選擇性最大的因素。因此，第二大方法開(kāi)發(fā)的建議是篩選具有不同固定相化學(xué)的色譜柱。這種方法有幾個(gè)好處，包括快速發(fā)現(xiàn)適合你的分析物分離的最佳固定相以及正交（互補(bǔ)）的固定相篩選可以讓你發(fā)現(xiàn)潛在的雜質(zhì)峰，而如果只是篩選相似的固定相（比如不同品牌的C18柱），這些雜質(zhì)峰可能就不會(huì)被發(fā)現(xiàn)。其他影響選擇性的參數(shù)有流動(dòng)相的有機(jī)溶劑，流動(dòng)相pH，流動(dòng)相添加劑和溫度。

圖1 三個(gè)色譜參數(shù)對(duì)分離度的影響

3. 使用探索性梯度（Scouting Gradient）

一個(gè)探索性梯度是一種線性的梯度：在一個(gè)設(shè)定的時(shí)間里，從5-10% B到100% B（20 min是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間）。在100% B的洗脫強(qiáng)度處維持幾分鐘，以確保所有的成分都已經(jīng)被洗脫出來(lái)。對(duì)于反相梯度洗脫，水（或者緩沖液，如存在可離子化分析物）和乙腈是最典型的洗脫液選擇。使用揮發(fā)性緩沖液（比如甲酸銨）會(huì)使得方法兼容LC-MS中的質(zhì)譜檢測(cè)器。獲得的色譜圖可以揭示關(guān)于流動(dòng)相組成、色譜柱化學(xué)以及分離需要的分析模式的很多信息。如果化合物在大于梯度時(shí)間的25%洗脫出來(lái)，那么這個(gè)分析方法需要洗脫更強(qiáng)的B相或者更小保留的色譜柱。另外，下面的方程式（tg表示探索性梯度時(shí)間）可以被用于決定是否等度分離是可能的，畢竟等度方法由于可以簡(jiǎn)化分析以及獲得更高的樣品通量而更受歡迎。

當(dāng)建立的方法為梯度方法時(shí)，第一個(gè)峰洗脫出來(lái)的流動(dòng)相組成應(yīng)該被用于起始流動(dòng)相組成。

本文翻譯自LCGC Europe Volume 32, Issue 11, pg 619，Top Three HPLC Method Development Tips，作者：LCGC's CHROMacademy

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